미생물학 Chapter 4 [염색편] Gram염색/AFB염색

I. 세균 염색의 의의

 1) 세균의 분류와 동정은 불가하다.

 2) 검체 내의 세균 유무와 대략적인 균 수를 파악 할 수 있다.

 3) 세균의 염색상과 형태를 보아 균종이 추정되어 세균 동정 방향을 결정할 수 있으며, 세균 감염증 진단에 도움이 되고 또한 조기에 항생물질의 선택방침이 결정된다.

 

II. 세균 염색법과 색소

세균 염색에 쓰이는 염색제의 대부분은 aniline 색소이고 염기성 색소와 산성색소가 있다. 염산염, 나트륨염, 칼륨염 등의 염 형태로 시판된다. 염기성 색소는 해리되어 양(+)의 하전을 가진 색소분자(양성 하전)를 유리하며, 산성 색소는 그 반대로 음(ㅡ)의 하전을 가진 색소분자(음성 하전)를 유리한다.

세균의 균체에는 핵상이 다량 함유되어 있고 그 인산기는 음성 하전이므로 양성 하전의 염기성 색소와 잘 결합하여 염색된다. 한편 조직세포의 세포질은 양성 하전이므로 산성 색소로 염색된다.

염기성 염색 색소는 methylene blue, basic fuchsin, crystal violet, safranin O, bismark brown 등이 있고 염색성을 높이기 위하여 염색촉진제로서 석탄산, 수산화칼륨, 식초산 등이 첨가된다. 그리고 매염제(mordant)로서 탄닌산, 피크린산, 명반(alum), 황산제1철 및 요오드 등이 사용된다. 세포성분과 색소와의 결합력에는 강약이 있어서 목적 이외의 것에도 염색되는 일이 있으므로 일단 염색한 것을 선택적으로 탈색하는 방법이 채택된다. 탈색제는 순 alcohol, acetone, 3% HCL alcohol 등이 쓰인다. 염기성 색소에 잘 염색되는 세포를 호염기성, 산성 색소에 잘 염색되는 세포를 호산성이라고 부르는 경우도 있다.

 

III. 염색법의 종류

 염색법의 기본적 순서는 도말-건조-고정-염색-수세-건조-검경이다. 목적하는 세균의 종류에 따라 염색법이 달라진다.

 

1. 단염색

 한 종류의 색소액으로 간단히 한번만 염색하는 방법이다. 세균의 형태, 배영을 볼 때 시행한다. 대표적인 염색액으로는 Loeffler의 alkaline methylene blue액 과 Pfeifer의 fuchsin액 등이 있다. 

 

2. 감별염색

 세균 감별에 쓰이는 염색법으로서 그람 염색과 항산성균 염색이 있다. 형광염색법, 형광을 표식한 특이항체와의 반응에 의한 형광항체법도 최근 응용하게 되었다.

 

 1) 그람 염색(Gram stain)

시약 구성으로는 Crystal violet, Iodine, 50% acetone alcohol, Safranin O 4가지로 구성되있다

염색 순서는 도말이 완료된 검체에 Crystal violet을 충분히 분무한다 -> 60초 -> 수세 -> Iodine을 슬라이드에 분무한다 -> 60초 -> 수세 -> 탈색(50% acetone alcohol) -> 30초 -> 수세 -> Safranin O 슬라이드에 분무한다 -> 60초 -> 수세

이러한 과정을 거치게 되면 그람양성균은 Crystal violet 시약 색깔인 보라색으로 나타나게 되고 그람음성균은 Sfranin O 색깔인 자색으로 염색되게 된다. 이렇게 감별염색이 되는 이유는 그람양성균과 그람음성균의 세포벽을 이용하기 때문이다. 그람양성균의 세포벽이 음성균보다 세포벽이 더 두껍기 때문에 탈색과정에서도 양성균의 벽은 녹지 않게 된다. 반대로 음성균은 탈색액에 의해 세포벽이 녹게된다. 따라서 Safranin O 염색액을 가하게되면 음성균만 탈색되어 자색으로 물들게된다. 이러한 원리를 이용하여 양성균과 음성균이 감별염색된다. 결국은 Gram stain의 최종목적은 균의 유무와 그리고 양성균과 음성균의 감별이 되겠다.

 

2) 항산성균 염색

 결핵균, 나균, 비정형 항산성균, 일부 방선균은 세포질내에 많은 양의 lipid, fatty acid wax 등이 있으므로 보통 염색법으로는 염색이 안 되고 고농도의 염기성 색소를 놓고 가온염색하면 염색이 된다. 일단 염색이 된 것은 산이나 alcohol에 의해서도 탈색이 잘 안 된다. 이와 같은 항산성을 보이는 균의 염색법을 항산성균 염색이라고 한다. 대표적으로 Ziehl-Neelsen법이 있다.

Ziehl-Neelsen법의 시약구성은 Carbol fuchsin, 3% HCL, Metylene blue로 구성된다.

염색 순서는 도말이 완료된 검체에 Carbol fuchsin을 분사한다. -> 알코올램프등 열을 이용하여 가열한다. ( ★ 이때 가열을 멈춰야 할 시점은 절대 끓으면안되고 슬라이드에서 연기가 피어 오를때까지 가열한다★) -> 5분간 대기 -> 수세 -> 탈색(3% HCL) 분사 -> 30초대기 -> 수세 -> Methylene blue 용액 분사 -> 60초대기 -> 수세

이렇게 과정을 거치고 나면 항산성균은 적색으로 나타나고 나머지 균, 기타 세포들은 파란색으로 나타난다.

염색의 원리는 항산성균들은 세포벽이 월등이 두껍다. 이들의 세포벽은 가열, 강산(HCL)을 가하여도 녹지않는다 하지만 다른균들은 다 녹게된다. 그래서 오로지 항산성균만이 적색으로 남게된다. 

또한 항산성균 염색으로는 형광염색법이 있다. 미생물학회에서 형광염색법을 적극 추천하고 있지만 값 비싼 형광현미경이 필요하고 암시야가 될 수 있는조건과 여러가지 시설을 갖춰야 하므로 대학병원급에서만 시행하고 있다. 대부분은 임상에서는 Ziehl-Neelsen법을 사용하고 있다.

 

3. 특수염색

 세균의 특수한 구조를 예를 들면 협막, 편모, 이염소체 등을 관찰할 때에 특수 염색을 한다.

 협막은 단염색 또는 그람염색에 의해서도 균체 주위에 불염성 막(halo)으로서 관찰된다. 협막염색을 하면 명료해진다. Hiss의 방법이 있다. 균체는 짙은 자색, 협막은 연한 청색으로 염색된다. Cryptococcus의 두꺼운 협막은 India ink법에 의해서도 관찰된다.

 운동성 균은 편모를 가지고 있다. 편모는 물리적인 처리로 쉽게 파괴된다. 편모염색에는 몇 가지 방법이 있는데 Leifson의 방법이 가장 일반적이다. 편모의 존재는 현적표본검사, 반유동 한천배지의 혼탁 등으로 간접적인 인지가 된다.

 아포는 단염색, 그람 염색에서도 불염성 소체로서 관찰된다. 아포염색에는 Moller의 방법이 있다. 아포는 적색, 균체는 청색으로 염색된다. 계대배양균, 어린 배양균에서는 아포가 형성되지 않는다.

 이염소체는 디프테리아 균의 특징 중 하나의 중요한 점이다. Neisser의 염색방법, Albert의 염색방법, Cowdry 변법으로 염색하면 이염소체는 흑갈색으로, 균체는 황색으로 염색된다. 이 소체는 일명 Neisser 소체라도 한다.

 핵염색에는 도말표본을 osmic acid 증기로 고정하고 염산으로 처리 후 Giemsa 염색을 하는 방법과 DNA를 특이적으로 염색하는 Feulgen법 및 형광법이 있다.